Mortadelo

Es sin duda el principal protagonista de estos cómics. Alto, calvo, con gafas y siempre enfundado en una levita negra, cuando no está probándose uno de sus infinitos disfraces. La capacidad para disfrazarse de Mortadelo es su característica más significativa y divertida. En un momento puede ser un león, una piedra, un soldado, como un marciano o una chispa eléctrica. Empezó junto con su jefe, Filemón, formando una pareja de detectives privados, buscando resolver de las maneras más disparatadas los casos que llegaban a sus manos. Posteriormente, ingresaron en la TIA (Técnicos de Investigación Aeroterráquea), donde trabajan como agentes secretos. Con ellos están el Superintendente Vicente (el "Súper"), que es su inmediato superior, el Profesor Bacterio, un científico loco, y la Señorita Ofelia, secretaria del "Súper".

Filemón

Compañero inseparable de Mortadelo, Filemón Pi es además su jefe ya desde sus tiempos de detectives. Dos únicos pelos en la cabeza, camisa blanca, pantalón rojo y pajarita, es el aspecto que invariablemente presenta. Las discusiones y peleas con Mortadelo son frecuentes, tanto es así, que la mayor parte de las historietas que protagonizan, acaban con una persecución de Filemón a Mortadelo, o con una del "Súper" a los dos.

El Super

El Superintendente Vicente, el "Súper", tiene a su mando a todos los agentes de la TIA, incluídos Mortadelo y Filemón, de los cuales no tiene muy buen concepto. Cuando les ofrece una misión es casi siempre porque no tiene a ningún otro agente disponible, o porque es de tal peligro, que no merece la pena arriesgar a nadie más que a ellos. Siempre vestido con su traje azul y luciendo en su cara un poblado bigote, el "Súper" es el que acaba pagando los platos que rompen nuestra pareja de agentes.

El profesor Bacterio

Inventor y científico loco, de aspecto encorvado, calvo y con barba, el Profesor Bacterio trabaja en la TIA, creando nuevos y revolucionarios inventos y fórmulas para ayudar a la organización. Sus creaciones son generalmente fracasos, que sufren en sí mismos Mortadelo y Filemón, que son habitualmente los elegidos para probarlos.

Ofelia

Es la secretaria del "Súper". Rubia, algo gordita (aunque nunca lo reconozca), tiene un carácter fortísimo y siempre está discutiendo con Mortadelo y Filemón, aunque está locamente enamorada de Mortadelo y no pierde oportunidad para hacérselo ver. Es el último personaje que se ha incorporado de forma continuada a las historietas.